将自动化和基础发现融入非传统微生物的设计-构建-测试-学习循环（中）

跟踪智慧实验室的理论研究发展状况、产业发展动态、主要设备供应商产品研发动态、国内外智慧实验室建设成果现状等信息内容。本文由中科院上海生命科学信息中心与曼森生物合作供稿。

本期推文编译了 Gurdo N 等发表在 Trends in Biotechnology 期刊上的综述《将自动化和基本发现融入非传统微生物的设计-构建-测试-学习循环》（Merging automation and fundamental discovery into the design-build-test-learn cycle of nontraditional microbes），该文作者提出了一种“以代谢为中心”的合成生物学设计-构建-测试-学习循环的方法，并得到多组学分析的支持。

因文章篇幅较长，将分为三期来讲述。感谢关注！

目录/CONTENT

01/要点

02/用于生物生产的传统和新兴微生物平台的调查

03/生物铸造厂利用模型微生物宿主推进生物生产

04/生物铸造厂的细胞工厂设计和测试自动化

05/通过自动化和扩展合成生物学工具箱，为基于非传统宿主的细胞工厂铺平道路

06/引入以代谢为中心的分析作为发现平台，指导 DBTL 循环中的工程工作

07/观点总结和未来方向

08/未解决的问题

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将自动化和基础发现融入非传统微生物的设计-构建-测试-学习循环（上）

04 生物铸造厂的细胞工厂设计和测试自动化

自动化技术正日益融入合成生物学和代谢工程。通常，构建一个含有相对简单的合成代谢途径的细胞工厂需要至少十个单独的 DNA 模块。这些遗传部分必须以多种配置进行重新排列，以产生以合理滴度产生所需产物的变体——这使得人工构建 DNA 组装既不切实际又耗时。相比之下，自动化为细胞工厂设计和建造提供了高效、标准化的解决方案。一个主要的挑战是以快速有效的方式测试植入给定宿主的基因构建体的大组合，同时了解每个修饰对最终表型的生物学意义。生物铸造厂拥有在由机器人液体处理器控制的集成分子生物学设施中处理大量遗传构建体的能力，结合高通量分析并由专用软件支持。DNA 构建体快速原型的生物铸造简化方案如图1A所示。学术生物铸造厂的一个值得注意的方面是，整个工作流程仍然没有完全自动化或在 DBTL 周期的所有级别进行集成。细胞 工厂建设中的中间步骤需要广泛的优化，大部分在平台外手动（至少部分）执行。此外，到目前为止，自动化在提供关于新陈代谢的深刻基础信息方面的能力还没 有得到充分利用。

图1.自动化生物铸造厂微生物生理学和代谢的基本发现。（A） 微生物原型自动化平台的总体方案。机器人液体处理器组件根据其功能以不同的颜色或位置显示。该平台包括 PCR 机（黄色）、电穿孔站（浅蓝色）、培养装置（绿色）、 分光光度计（浅红色）、搬运机械臂（顶部）、尖端盒（白色）和快速过滤装置（右侧，浅橙色）。所有这些组件都放在一个化学罩中。（B）通过快速质粒构建、转化、质粒纯化、治愈和基因分型介导的自动基因组工程。流水线中的不同步骤如下：（i）通过 PCR 从标准零件（标准欧洲载体结构，SEVA）进行遗传零件组装；（ii）将 PCR 产物转化为化学活性大肠杆菌，随后进行测序确认；（iii）质粒 DNA 纯化和转化为非传统目的宿主；和（iv）单个克隆的质粒固化和基因型检查。整个过程原则上可以在4-5 天内完成，并在基本上任何革兰氏阴性细菌宿主上产生菌株变体库。缩写：OD，光密度；PCR、聚合酶链反应。

传统微生物宿主（主要是大肠杆菌）的正向工程在 DBTL 循环的设计-构建阶段利用了生物铸造厂的潜力。最近的两个例子说明了工程大肠杆菌用于（2S）-黄烷酮和十二醇生物生产的半自动化方法。第一个例子是通过在自动化管道中组装表达构建体的组合文库来优化不同类黄酮的生物合成过程。基因部分被设计为通过连接酶循环反应与 DNA 组装完全兼容，并通过液体处理机器人平台执行计算机移液工作流程。应用这种半自动 DBTL 程序，以甘油为原料，获得了高滴度的柚皮素（484 mg/l）、松脂素（198 mg/l），高滴度（55 mg/l，以咖啡酸酯为原 料）和后莫圣草素（17 mg/l）。在第二个例子中，使用基因库和核糖体结合位点 （RBS）系统地操纵基因表达强度，用于十二醇生物生产。通过测试来自大肠杆菌 MG1655 的 60 株工程菌株，实施了两个连续的 DBTL 循环以增强葡萄糖的产物形成。在第一次迭代中，通过采用一组预测强度不同的 RBS 来调节不同酰基 载体蛋白（ACPs）/酰基辅酶 A（CoA）还原酶基因的表达。硫酯酶和酰基辅酶 A 合成酶基因同样被纳入这些设计中。接下来，将这些实验中产生的蛋白质浓度和产品产量数据输入机器学习算法，以预测进一步的优化步骤。基于计算机预测 的第二次迭代使十二醇滴度（0.83±0.13 g/l）比第一次循环的基础菌株提高了21%。重要的是，Opgenorth 及其同事的研究在实现机器学习算法提出的设计时暴露了缺点。挑战包括（i）可用RBS对蛋白质含量的可预测性有限，（ii）途径 蛋白的非靶向效应（例如 FadD 酰基-辅酶 A 合成酶的表观毒性），（iii）通过改变 单个 RBS（例如极性）带来的整体操纵子效应，（iv）当使用密切相关（与完全 组合相反）构造的训练集时，掩盖整个数据空间中的局部趋势，以及（iv）需要大数据集来可靠地训练机器学习路径。

最近的另一项研究描述了一种半自动管道，用于优化酿酒酵母工程菌株生产白桦酸（一种五环三萜）。作者应用了 SCRaMbLE，这是一种体内诱导的合成染色体缺失系统，目的是生成多样化的菌株库。白桦酸途径模块的设计和构建阶段 是手动进行的，而测试部分是通过实施自动化高通量筛选方法来执行的。因此， 该文描述了使用酵母细胞工厂的全自动化生物生产过程的最接近的例子之一，有可能包含实现完全自动化的额外步骤。另一种真菌物种假土曲霉（Aspergillus pseudoterus）已进行了深入的、多组学指导的工程，用于聚合物前体 3-羟基丙酸 （3-HPA）的糖依赖性生物合成——在生物反应器培养物中，滴度可达 0.88±0.11 g/l。该方法基于蛋白质组学和代谢组学，鉴定能够从预期的 3-HPA 合成途径排出通量的上调蛋白。建立了合成β-丙氨酸依赖的产物形成途径，并通过删除负责 3-HPA 降解的丙二酸半醛脱氢酶基因（Apald6）重新定向乙酰辅酶 A 通量。

这个章节的讨论提供了自动化潜力的原理示例。这些开创性的研究还揭示了一个事实，即大体上，模式生物是首选的生物铸造宿主。只有将细菌宿主的种类大大扩展到大肠杆菌之外，特别是生产非普通化学品，生物铸造厂的全部潜力才能实现。这项工作需要一个自动化的管道来实现非模型生物的合成工具集，同时需要组学驱动的对其代谢和生理学基础知识的扩展。下一节将讨论生物铸造厂如何成为这方面的关键参与者。

05 通过自动化和扩展合成生物学工具箱为基于非传统宿主的细胞工厂铺平道路

体内 DNA 模块的构建和组装以及从头途径设计是细胞工厂开发的重要组成部分。将这些技术推广到非传统宿主可以标志着从缓慢驯化到合理设计的转变， 克服复杂代谢网络和有限的微生物生理学知识带来的障碍。由于物种间的功能不相容性（例如，RecA 介导的重组较差），为生物技术主流的基因工程建立的方法很难转移到非模型宿主。最近为非模式生物量身定制了一些尖端技术，但仍有很大的改进空间——尤其是在准确表征这些替代宿主中的工具方面。将非传统微生物整合到生物铸造管道中，不仅可以开发出新的（潜在的，更高级的）细胞工厂， 而且还将刺激对这些宿主的基础研究。生物铸造厂可以生产大量的表型和组学数据，如果这些数据被广泛提供给科学界，将成为学术界和工业界研究的指导资源。对新分离的微生物及其工具箱进行表征，这项过去需要几十年的努力，现在可以简化并以很小的时间和成本进行。稍后将讨论假单胞菌的基因组工程，以说明生物铸造厂在实现这些目标方面可能发挥的作用。

工具箱优化和大规模复用是 DBTL 周期构建阶段的两个重要方面，以释放非传统主机作为单元工厂的潜力。假单胞菌基因组工程已经针对手动工作流程进 行了优化，但它可以进一步发展为自动化设置。到目前为止，最快的恶臭假单胞菌基因缺失方案需要将自杀质粒共整合到感兴趣的位点中。整合位点和要切除的区域由自杀质粒中两个同源臂（HA）的序列决定；用户可以自由选择这些臂来介导细菌染色体中几乎任何位置的同源重组（HR）事件。通过在 HA 中加入遗传元素，这些特征同样可以整合到目标基因座中。通过从辅助质粒表达基因而反 式提供的 I-SceI 归巢巨核酸酶引入双链 DNA 断裂，从而迫使第二个 HR 事件从基因组中移除质粒骨架和靶区。通过将质粒复制的合成控制纳入所谓的 pQURE 质粒工具集，这一策略得到了升级，通过向培养基中添加 3-甲基苯甲酸盐，可以 严格控制质粒的繁殖。然而，这些方法的潜力有待充分挖掘。例如，自动化可以用于在几轮迭代中生成大型构造库。为此，可以采用克隆标准，例如标准欧洲向量架构（SEVA），以模块化方式组装复杂回路，从而产生与许多革兰氏阴性宿主兼容的广泛宿主范围构建体，同时促进遗传部分的可重用性。在这里，作者提出了一个通过自动化和并行化相结合的非传统革兰氏阴性菌快速基因组工程的原型工作流（图1B）。该工作流程包括（i）遵循标准的模块化 DNA 部分的平行和自动组装、（ii）用组装的构建体对大肠杆菌进行电转化，（iii）高通量纯化质粒 DNA 并用质粒文库转化所需宿主，随后（iv）用自固化 pQURE 载体转化并对所得无质粒菌株变体进行基因分型。该工作流程中的所有步骤都可以通过集成在机器人平台中的自动液体处理器轻松控制。

虽然已知该工作流程中提到的所有技术都可单独应用于 P.putida，但需要对其他宿主中的功能元件和部件（例如抗生素标记、基因表达系统、HR 机制和效率、转化方案和反选择标记）进行快速和自动原型设计，以验证其性能。可使用广泛使用的技术（例如，USER 克隆、Golden Gate 克隆、Gibson 组装或 SureVector） 组装此类管道中使用的质粒，并且根据所选择的方法，自动化协议最近已经可用。按照标准化的克隆策略，一旦创建了大多数部分，就可以重新用于多种构建体——例如质粒主干。鉴于整合质粒中作为 HA 所需的特定 PCR 扩增子大小相等（约 500 bp），而不考虑靶点，这些 HA 可以以高通量方式获得，例如 96 孔板（图 1B 中的步骤 1）。对于许多克隆策略，DNA 片段的组装可以在相同的布局中进行， 甚至无需事先纯化。一旦质粒组装好，它们就以 96 孔电穿孔板形式转入大肠杆菌进行繁殖（图 1B 中的步骤 2）。通过克隆 PCR 和 Sanger 测序验证质粒的正确 性。再次，使用标准化引物集进行验证，这样这一步骤也可以自动化。由于 Sanger 测序价格合理，克隆效率通常很高，这种方法既具有经济竞争力，又快速，因为不需要 DNA 纯化或凝胶电泳，从而实现高通量。图1B 中的步骤 3 说明了使用 市售 DNA 提取试剂盒以 96 孔板形式纯化质粒。然后通过电穿孔、化学转化或缀合将纯化的质粒引入感兴趣的（非传统）宿主中，回收后，将细胞接种到选择性培养基上以选择亚倍体。请注意，将细菌悬浮液分散到选择性琼脂平板上以分离单个菌落是序列中的关键步骤，但基本上没有实现这一目的的全自动化、高效的方案。该方案的最后一部分（图 1B 中的步骤 4）涉及通过在亚二倍体克隆中引入 pQURE 系统来强制第二次HR事件，然后进行质粒固化。可以使用阴性选择标记（例如，sacB）来促进质粒消除，从而实现更高的产量。序列的最后一步是通过克隆 PCR 和 Sanger 测序进行基因型确认，如质粒构建阶段所示。此时， 菌株库已准备好进入测试阶段，即多组学方法促进的代谢网络分析。

未完待续

参考文献：Gurdo N, Volke DC, Nikel PI. Merging automation and fundamental discovery into the design-build-test-learn cycle of nontraditional microbes. Trends in Biotechnology. 2022;40(10):1148-59.

Mediacenter Editor | 曼森编辑

文章来源：本文由中科院上海生命科学信息中心与曼森生物合作供稿

排版校对：刘娟娟编辑

内容审核：郝玉有博士